3 mënyra për të bërë metodën e ngjyrosjes së Gramit

2024 Autor: Jason Gerald | [email protected]. E modifikuara e fundit: 2023-12-16 11:39

Ngjyrosja e gramit është një teknikë e shpejtë dhe përdoret për të parë praninë e baktereve në një mostër të indeve dhe për të klasifikuar bakteret si gram-pozitive ose gram-negative, bazuar në vetitë kimike dhe fizike të mureve të tyre qelizore. Ngjyra e gramit përdoret pothuajse gjithmonë si hapi i parë në diagnostikimin e një infeksioni bakterial.

Kjo teknikë e ngjyrosjes është emëruar pas shkencëtarit danez Hans Christian Gram (1853 - 1938), i cili e zhvilloi teknikën në 1882 dhe e publikoi atë në 1884 si një teknikë për dallimin midis dy llojeve të baktereve me simptoma të ngjashme klinike: Streptococcus pneumoniae (i njohur gjithashtu si Streptococcus pneumoniae). Pneumokoket) dhe bakteret Klebsiella pneumoniae.

Hapi

Metoda 1 nga 3: Përgatitja e Rrëshqitjes së Mikroskopit

Hapi 1. Përgatituni për të punuar në laborator

Vishni doreza dhe një kravatë flokësh të gjatë për të parandaluar kontaminimin bakterial të mostrës që po testoni. Pastroni hapësirën e punës nën një kapak tymi, ose në një zonë tjetër të ajrosur mirë. Kontrolloni ndezësin Bunsen dhe sigurohuni që mikroskopi të funksionojë siç duhet para se të filloni.

Hapi 2. Sterilizoni rrëshqitjen e xhamit të mikroskopit

Nëse rrëshqitësi i xhamit është i ndotur, lajeni atë me ujë me sapun për të hequr vajin dhe papastërtitë. Pastroni rrëshqitjet me etanol, pastrues xhami, ose një metodë tjetër të përdorur nga laboratori juaj.

Hapi 3. Vendoseni mostrën në rrëshqitjen e xhamit

Ju mund të përdorni teknikën e njollës Gram për të ndihmuar në identifikimin e baktereve në një mostër mjekësore, ose një kulturë bakteresh që rriten në një pjatë petri. Për rezultate më të mira, përdorni njollën Gram në goditje të hollë të mostrës. Shtë e këshillueshme të përdorni mostra që janë më pak se 24 orë të vjetra, pasi bakteret më të vjetra mund të kenë dëmtuar muret e tyre qelizore dhe mund të mos reagojnë ndaj ngjyrosjes Gram.

Nëse përdorni një mostër të indeve, shtoni 1-2 pika në një rrëshqitje qelqi. Përhapeni në mënyrë të barabartë në rrëshqitje për të formuar një shtresë të hollë të spërkatjes së mostrës, duke e rrëshqitur duke përdorur skajin e rrëshqitjes tjetër qelqi sterile. Lëreni të thahet para se të bëni hapin tjetër.
Nëse jeni duke marrë baktere nga një pjatë petri, sterilizoni lakun e vaksinimit në një furrë Bunsen derisa të shkëlqejë, pastaj lëreni të ftohet. Përdorni lakun për të pikuar ujë steril në rrëshqitje, pastaj sterilizoni dhe ftohni përsëri para se ta përdorni për të mbledhur një mostër të vogël të baktereve. Pas kësaj, përzieni butësisht.
Bakteret e përgatitura në supë duhet të përzihen përsëri duke përdorur një vortexer, pastaj merren me lakun e vaksinimit si më sipër, pa shtuar ujë.
Nëse keni një mostër shtupë (zakonisht bëhet me një dorezë të vogël me majë pambuku), prekni dhe rrotulloni butësisht shtupën mbi rrëshqitje.

Hapi 4. Një temperaturë pak e lartë mund të bëjë një njollë të mirë

Nxehtësia do të mbajë bakteret në majë të rrëshqitjes, kështu që ato nuk treten lehtë gjatë procesit të ngjyrosjes. Prekni rrëshqitjen shpejt dy deri në tre herë mbi një djegës Bunsen ose ngrohni rrëshqitjen mbi një ngrohës elektrik rrëshqitës. Mos e ngrohni shumë, mostra mund të dëmtohet. Nëse jeni duke përdorur një djegës Bunsen, duhet të jetë një flakë e vogël por blu në vend të një flake të madhe portokalli.

Përndryshe, një njollë gjithashtu mund të bëhet me metanol, duke shtuar 1-2 pika metanol në një njollë të thatë, duke tharë metanolin e mbetur në rrëshqitje duke e lënë atë në ajër të hapur. Kjo teknikë minimizon dëmtimin e qelizave dhe siguron një sfond të pastër të imazhit të rrëshqitjes

Hapi 5. Vendoseni rrëshqitësin mbi tabaka për ngjyrosje

Tavat e ngjyrosjes janë bërë prej metali, qelqi ose pllaka plastike të cekëta me një rrjetë të butë që rreshton pjesën e sipërme. Vendosni rrëshqitësit në majë të këtyre rrjetave, në mënyrë që lëngu që përdorni të kullojë në tabaka.

Nëse nuk keni një tabaka për ngjyrosje, mund të vendosni një rrëshqitje në një tabaka plastike për të printuar kube akulli

Metoda 2 nga 3: Procesi i njollës Gram

Hapi 1. Derdhni lëngun vjollce kristal mbi njollën

Përdorni një pipetë për të spërkatur një mostër të baktereve me disa pika ngjyrë vjollce kristali, e njohur gjithashtu si vjollce gentiane. Lëreni për 30-60 sekonda. Vjollca kristal (KV) ndahet në tretësirë ujore në jonet KV+ dhe klorur (Cl-). Këta jone depërtojnë në muret qelizore dhe membranat qelizore të baktereve gram-pozitive dhe gram-negative. Joni KV+ ndërvepron me përbërësit e ngarkuar negativisht të qelizave bakteriale, duke i dhënë qelizave një ngjyrë vjollce.

Shumë laboratorë përdorin vjollce kristali "Hucker", e cila përmban oksalat amoniumi për të parandaluar reshjet

Hapi 2. Shpëlajeni vjollcën Kristal butësisht

Anojeni rrëshqitjen dhe përdorni një shishe larëse për të spërkatur një rrjedhë të vogël uji të distiluar ose rubinet mbi rrëshqitje. Uji duhet të rrjedhë mbi sipërfaqen e njollës dhe nuk duhet të spërkatet drejtpërdrejt në njollë. Mos e shpëlani me tepri. Mund të heqë njollat në bakteret Gram pozitive.

Hapi 3. Shpëlajeni njollën me jod, më pas shpëlajeni

Përdorni një pikatore për të shpëlarë njollën me jod. Lëreni të veprojë për të paktën 60 sekonda, pastaj shpëlajeni me kujdes në të njëjtën mënyrë si më sipër. Jodi, në formën e një joni të ngarkuar negativisht, ndërvepron me KV+ për të formuar një kompleks të madh të përbërë midis vjollcës së kristaltë dhe jodit (kompleksi i përbërjes CV-I) në shtresat e brendshme dhe të jashtme të qelizës. Ky kompleks i komponimeve do të ruajë ngjyrën vjollce të vjollcës kristalore brenda qelizës, në vendet e njollosura.

Jodi është një substancë gërryese. Shmangni thithjen, gëlltitjen ose kontaktin me lëkurën

Hapi 4. Shtoni zbardhues me ngjyra, pastaj shpëlajeni shpejt

Përzierja 1: 1 e acetonit dhe etanolit përdoret zakonisht për këtë hap të rëndësishëm, i cili duhet të caktohet me kujdes. Vendoseni rrëshqitjen në një kënd të caktuar, pastaj shtoni zbardhuesin e ngjyrës derisa të mos jetë më e purpurt në ujë të përdorur për shpëlarje. Kjo zakonisht merr më pak se 10 sekonda, apo edhe më pak kohë nëse zbardhuesi përmban një përqendrim të lartë të acetonit. Ndaloni këtë hap menjëherë, përndryshe bojë gjithashtu do të rrjedh vjollce kristali nga qelizat gram-pozitive dhe negative, dhe procesi i ngjyrosjes duhet të përsëritet. Shpëlajeni menjëherë çdo zbardhues me ngjyrë të tepërt duke përdorur teknikën e mëparshme.

Acetoni i pastër (95%+) mund të përdoret si zëvendësues. Sa më shumë aceton të përdorni, aq më shpejt zbardhuesi do të funksionojë, kështu që ju duhet t'i kushtoni më shumë vëmendje kohës.
Nëse e keni të vështirë të mbani shënimin e kohës për këtë hap, shtoni zbardhues të ngjyrave pikë për pikë.

Hapi 5. Spërkateni kundër-ngjyrën mbi njollën, më pas shpëlajeni

Një njollë kundër, zakonisht safranin ose fuchsin, përdoret për të rritur kontrastin midis baktereve gram-negative dhe gram-pozitive, duke ngjyrosur bakteret e çngjyrosura (të çngjyrosura), pra bakteret gram-negative, rozë ose të kuqe. Lëreni për të paktën 45 sekonda, pastaj shpëlajeni.

Fuchsin do të njollosë intensivisht shumë baktere gram-negative, të tilla si Haemophilus spp dhe Legionella spp. Kjo metodë është e mirë për fillestarët

Hapi 6. Thani rrëshqitjen

Ju mund t'i thani ato në ajër të hapur për t'u tharë, ose t'i thani duke përdorur letër biblike të shitur për këtë qëllim. Procesi i ngjyrosjes Gram është përfunduar.

Metoda 3 nga 3: Kontrollimi i rezultateve të ngjyrosjes

Hapi 1. Përgatitni mikroskopin e dritës

Vendoseni rrëshqitjen nën mikroskop. Bakteret ndryshojnë shumë në madhësi, kështu që zmadhimi i përgjithshëm i kërkuar do të ndryshojë nga 400x në 1000x. Një lente objektive me vaj zhytjeje rekomandohet për një imazh më të mprehtë. Hidhni vajin e zhytjes në rrëshqitje, duke shmangur lëvizjen gjatë pikimit për të parandaluar formimin e flluskave. Lëvizni dorezën e thjerrëzave të mikroskopit në mënyrë që lentet objektive të kapen në vend dhe të prekin vajin.

Zhytja e vajit mund të përdoret vetëm në lente të dizajnuara posaçërisht, jo në lente "të thata"

Hapi 2. Përpiquni të identifikoni bakteret gram pozitive dhe gram negative

Shqyrtoni rrëshqitjen nën një mikroskop të lehtë. Bakteret gram-pozitive shfaqen në ngjyrë vjollce, sepse vjollca kristal është bllokuar brenda murit të trashë të qelizës. Bakteret gram-negative do të kenë ngjyrë rozë ose të kuqe, sepse vjollca e kristaltë shpëlahet përmes mureve të hollë të qelizave, ku hyn kundër-ngjyra rozë.

Nëse mostra është shumë e trashë, rezultati mund të jetë një pozitiv i rremë. Ngjyrosni një mostër të re nëse tregon të gjitha bakteret gram pozitive, për t'u siguruar që rezultati është i saktë.
Nëse përdorni shumë zbardhues ngjyrash, rezultati mund të jetë një negativ i rremë. Ngjyrosni një mostër të re nëse tregon të gjitha bakteret gram negative, për t'u siguruar që rezultati është i saktë.

Hapi 3. Krahasoni rezultatet që shihni me imazhin e referencës

Nëse nuk e dini se si duken bakteret, studioni koleksionin e imazheve referuese, zakonisht të renditura sipas formës dhe njollës Gram. Ju gjithashtu mund të shihni bazat e të dhënave në internet në [Baza e të dhënave kombëtare të mikrobeve patogjene, bakteret në fotografi dhe shumë faqe të tjera në internet. Për të lehtësuar identifikimin, më poshtë janë shembuj të baktereve që hasen zakonisht ose janë të rëndësishme për diagnozën, të klasifikuara sipas statusit dhe formës së tyre Gram.

Hapi 4. Identifikoni bakteret gram-pozitive bazuar në formën e tyre

Bakteret klasifikohen më tej sipas formës së tyre nën mikroskop, më së shpeshti si kokë (sferike) ose shufra (cilindrike). Këtu janë disa shembuj të baktereve gram-pozitive (ngjyrë vjollce) sipas formës së tyre:

Kokë gram pozitivë zakonisht stafilokoket (që do të thotë koket e grupit) ose streptokokët (që do të thotë kokte zinxhir).
'Shufra gram -pozitive si Bacillus, Clostridium, Corynebacterium dhe Listeria. Bakteret e shufrës Actinomyces spp. zakonisht kanë degë ose fije.

Hapi 5. Identifikoni bakteret gram negative

Bakteret gram-negative (me ngjyrë rozë) shpesh klasifikohen në tre grupe. Kokët janë në formë sferike, shufrat janë të gjatë dhe të hollë, ndërsa shufrat kokoid janë në mes.

Kokë gram -negativ Më e zakonshme është Neisseria spp.
Shufra gram-negative p.sh. E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, dhe shumë të tjerë. Vibrio cholerae mund të shihet si një kërcell i rregullt ose një kërcell i përkulur.
Bakteret e shufrave "coccoid" (ose "coccobacilli") gram-negativ p.sh Bordetella, Brucella, Haemophilus dhe Pasteurella

Hapi 6. Kontrolloni me kujdes nëse rezultatet janë të përziera

Disa baktere janë të vështira për t'u ngjyrosur saktësisht, për shkak të brishtësisë ose natyrës dylli të mureve të tyre qelizore. Këto baktere mund të tregojnë një përzierje të purpurt ose rozë në të njëjtën qelizë, ose midis qelizave të ndryshme në të njëjtën njollë. Mostrat bakteriale më të vjetra se 24 orë mund ta tregojnë këtë problem, por ka edhe disa lloje bakteriale që mbeten të vështira për t'u ngjyrosur në çdo moshë të marrjes së mostrave. Këto baktere kërkojnë teste më të specializuara për identifikim, të tilla si ngjyrosje me acid të shpejtë, vëzhgim në kulturën bakteriale, media të kulturës TSI ose testim gjenetik.

Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium, dhe Propionibacterium spp. të gjitha janë baktere gram-pozitive, por shpesh nuk janë njollosur qartë.
Baktere të vogla, të holla si Treponema, Klamidia dhe Rickettsia spp. vështirë të njolloset me metodën Gram.

Hapi 7. Hidhni çdo harxhues dhe pajisje të mbetur

Kjo procedurë e depozitimit të mbeturinave ndryshon midis laboratorëve dhe varet nga materialet e përdorura. Në mënyrë tipike, lëngu në tabaka e ngjyrosjes hidhet në shishe të etiketuara si mbeturina të rrezikshme. Thithni rrëshqitjet në një zgjidhje zbardhues 10%, pastaj hidheni në një enë të mprehtë.

Këshilla

Mos harroni se rezultatet e njollës Gram do të jenë të mira vetëm nëse mostra është e mirë. Isshtë e rëndësishme të informohen pacientët në mënyrë që ata të mund të japin një mostër të mirë (p.sh., ndryshimi midis pështymës kundrejt kollës së thellë për të marrë një mostër pështymë).
Si zbardhues i ngjyrave, etanoli reagon më ngadalë se acetoni.
Respektoni rregullat standarde të laboratorit për të siguruar sigurinë.
Përdorni një shtupë faqe për të praktikuar, sepse përmban baktere gram-pozitive dhe gram-negative. Nëse shihni vetëm një lloj bakterie, mund të përdorni shumë pak ose shumë zbardhues.
Ju mund të përdorni kapëse druri për të siguruar rrëshqitjen.

Paralajmërim

Acetoni dhe etanoli janë substanca të ndezshme. Acetoni do të heqë vajin nga duart tuaja, duke e bërë më të lehtë për lëkurën tuaj të thithë kimikate të tjera. Vishni doreza dhe përdorni ato me kujdes.
Mos lejoni që njolla të thahet para se të shpëlani njollën Gram ose kundër njollën.